Є майже всі компанії, які продалипорошок ферменту бромелайнзмішується з папаїном. Важко очистити бромелайн до 5000GDU/г. але дуже легко очистити папаїн до 1000,000GDU/г. навіть до 2000 000 ГДУ/г. але функції бромелайну відрізняються від папаїну. колір, запах, розчинність у воді та смак відрізняються від підробленого та справжнього продукту. Вони відрізняються тим, що порошок ферменту бромелайн сірий, без запаху, смаку та нерозчинний у воді.
Але помилковий бромелайн має такі особливості:
● Він світло-жовтий, ароматний і м'яко солодкий, розчинний у воді. Це властивість папаїну.
● Використовується для зменшення запалення та полегшення болю. але цих функцій у папаїну майже немає.
● Він використовується лише як дієтична добавка, а не харчова добавка, але справді може бути фармацевтичним. Але папаїн використовується лише як порошок для м’якшення м’яса та косметика.
Ми перевірили бромелайн відповідно до SDS-PAGE гелю та GELATIN DIGESTION UNIT ANALYTICAL та HPLC методів, у методі SDS-PAGE гелю менше цільових молекул для підробленого продукту.
Нижче наведено результати електрофорезу SDS Page
Плями в наведеному вище показують, що лише правильний продукт має таку саму цятку в потрібному місці на зображенні, але підроблений продукт має невеликі цятки, що означає, що молекулярну масу ледве видно.
Молекулярна маса бромелайну становить близько 33000, але молекулярна маса папаїну становить 21000. А хроматограма ВЕРХ:
Ви побачите, що лише правильний екстракт містить правильну молекулярну масу бромелаїну та виявляється за допомогою ВЕРХ.
Але якщо ми перевіряли лише за допомогою аналітичного методу установки розщеплення желатину (GDU), див. Додаток II. Як правильний, так і помилковий продукт мають однакові результати, як показано нижче:
Стебло ананаса дуже дешеве, а швидкість переходу від стебла до бромелайну дуже низька, у процесі виробництва є певне забруднення.
Майже вся фабрика порошкового ферменту бромелайн знаходиться в ближньому полі. Використовують свіже стебло. Неможливо транспортувати стебло на великі відстані. Із сировиною слід працювати якомога швидше, коли її збирають із поля, або її слід зберігати в середовищі з низькою температурою (4-8 градусів), щоб уникнути деградації білка. У реальному житті виробник фактично не може виконати жодну з двох вищезазначених умов через занадто велику кількість стебел ананасів. Розумним методом є баланс між часом обробки та втратою активності білка. Зазвичай виробництво сирої сировини здійснюється в сезон збору врожаю ананасів, а сиру сировину зберігають у середовищі з низькою температурою (4-8 градусів).
Ми проводимо деякі тести щодо електрофорезу SDS Page. Теоретично ми можемо збільшити його до 10 000 або 20 000. але це буде дуже дорого. 5000 GDU/г і зробіть його стабільним, можливо, на підтримці мальто / мікрокапсульованому або щось подібне плюс екстракція/очищення органічного рівня.
Додаток І
● Метод 5 Електрофорез у поліакриламідному гелі SDS (SDS-PAGE)
SDS-PAGE – це метод електрофорезу в денатурованому поліакриламідному гелі. Принцип розділення білків у цьому методі заснований на тому факті, що більшість білків можуть з'єднуватися з аніонною поверхнево-активною речовиною додецилсульфатом натрію (SDS) у ваговому співвідношенні з утворенням комплексу
Негативний заряд, який несуть білкові молекули, значно перевищує чистий заряд природних білкових молекул, усуваючи ефект заряду різних білкових молекул і розділяючи білки відповідно до їх молекулярного розміру.
Цей метод використовується для якісної ідентифікації, контролю чистоти і домішок, кількісного визначення білків.
1 приладовий пристрій
Джерело живлення постійної напруги або постійного струму, резервуар для електрофорезу з вертикальною пластиною та форма для виготовлення клею.
2. Реактиви
(1) Вода.
(2) Роздільний гель-буфер (4x, розчин A) 1,5 моль/л тригідроксиметил-амінометан-соляно-кислотний буфер. Зважте 18,15 г тригідроксиметиламінометану та розчиніть його у відповідній кількості води. Доведіть значення рН до 88 за допомогою соляної кислоти та розведіть водою до 100 мл.
(3) Зважте 58.0г акриламіду та 20г N,N'- метиленбісакриламіду в 30% розчині акриламіду (розчин B), розчиніть у теплій воді та розбавте до 200 мл, відфільтруйте за допомогою фільтрувального паперу (зберігається в темний).
(4) Зважте 10 г додецилсульфату натрію в 10-відсотковому розчині SDS (розчин C), розчиніть у воді та розведіть до 100 мл
(5) Комерціалізаційний реагент розчину тетраметилетилендіаміну (ТЕМЕД, розчин D).
10-процентний розчин персульфату амонію (розчин Е) Зважте 10 г персульфату амонію, розчиніть у воді та розведіть до 100 мл. Рекомендується готувати перед використанням або зберігати окремо при -20 градусі протягом 2 тижнів.
(7) Концентрований каучуковий буфер (4 ×, розчин F) 0.5моль/л Тригідроксиметиламінометан Буфер хлористоводневої кислоти, зважте 6,05 г тригідроксиметиламінометану, додайте відповідну кількість води для розчинення, доведіть значення рН до 6,8 за допомогою соляної кислоти кислоти і розвести водою до 100 мл.
(8) Буфер для електродів (10 ×) Зважте 30 г триметиламінометану, 144 г гліцину та 10 г додецилсульфату натрію, розчиніть їх у воді та розбавте приблизно до 800 мл. Доведіть значення рН до 8.1-8.8 за допомогою соляної кислоти та розведіть водою до 1000 мл.
(9) Невідновлений буфер для зразків (4 ×) Зважте 303 г триметиламінометану, 20 мг бромфенолового синього та 8,0 г додецилсульфату натрію, відміряйте 40 мл гліцерину, розчиніть у воді та розбавте приблизно до 80 мл. Доведіть pH до 68 за допомогою соляної кислоти та розведіть водою до 100 мл.
(8) Буфер для електродів (10 ×) Зважте 30 г триметиламінометану, 144 г гліцину та 10 г додецилсульфату натрію, розчиніть у воді та розбавте приблизно до 800 мл. Відрегулюйте значення DH до 81-88 за допомогою соляної кислоти та розбавте до 1000 мл водою
(9) Невідновлений буфер для зразків (4 ×) Зважте 3,03 г триметиламінометану, 20 мг бромфенолового синього та 80 г додецилсульфату натрію, відміряйте 40 мл гліцерину, розчиніть у воді та розбавте приблизно до 80 мл. Доведіть pH до 6,8 за допомогою соляної кислоти та розведіть водою до 100 мл.
(10) Відновлений буфер досліджуваної речовини (4 ×) Зважте 3,03 г триметиламінометану, 20 мг бромфенолового синього та 80 г додецилсульфату натрію, відміряйте 40 мл гліцерину, розчиніть і розбавте водою приблизно до 80 мл і додайте - 20мл меркаптоетанолу, доведіть рН до 6,8 за допомогою соляної кислоти, розведіть водою до 100 мл (або 3,03 г триметиламінометану, 20 мг бромфенолового синього, 8,0 г додецилсульфату натрію, відміряйте 40 мл гліцерину, розчиніть у воді та розбавте до 80 мл, доведіть рН до 6,8 за допомогою соляної кислоти, розведіть водою до 100 мл і перед використанням додайте дитіотреїтол до 100 ммоль/л).
● Додаток II
Аналітичний метод блоку розщеплення желатину (GDU)
A. Мета: ця процедура використовується для визначення протеолітичної активності бромелайнового ферментного порошку.
B. Обладнання:
1. pH-метр
2. Водяна баня з постійною температурою 45.0 градусів ± 0.1 градуса
3. Аналітичні ваги
4. Мірні колби
5. Об'ємні піпетки
6. Таймер
7. Цифрова бюретка (точність 0.1 мл)
8. Витяжна шафа
9. Автоматичні піпетки
C. Заходи безпеки:
Цей тест необхідно проводити у витяжній шафі.
1. Використовуйте стандартні методи лабораторної безпеки.
2. Формальдегід: приготуйте та зберігайте у витяжній шафі весь час. Відомий канцероген і тератоген.
3. Перекис: Сильний окислювач
D. Реагенти та приготування реагентів:
1. Дистильована вода: приблизно 500 мл: доведіть рН до 4,5 за допомогою 0,1 н HCl.
2. Желатинова основа:
a. Розчиніть 25 грамів желатину (Mikrobiologie. 1.04070) у 375 мл гарячої води, доведіть до кипіння. Остудити до 45 градусів.
b. Доведіть рН до 4,5 за допомогою 0,1 N HCl і розведіть до 500 мл дистильованої води з рН 4,5.
в. Підтримуйте желатиновий субстрат при температурі 45 градусів.
3. Буферний розчин:
a. Повільно додайте 15 г NaCl до 40-50 мл води в склянці на 150 мл і перемішайте, щоб розчинити.
b. Додайте 0,570 мл оцтової кислоти.
в. Доведіть рН до 4,5 за допомогою 0.2N HCL (об’єм буде більшим за 100 мл.)
4. 3% перекис водню:
a. Відпіпетуйте 2,5 мл 30% перекису водню (базовий розчин) у мірну колбу на 25 мл і доведіть до об’єму дистильованою водою з pH 4,5.
5. 37 відсотків формальдегіду pH 9.0: a. Доведіть достатній об’єм (100 мл) формальдегіду до pH 9,0 за допомогою 0,1 N NaOH (приблизно 20 мл формальдегіду на зразок перед регулюванням pH).
Аналітичний метод установки розщеплення желатину (GDU) - продовж.
6. 0.100 N NaOH: (придбаний стандартизований) a. Базовий розчин: стандартизований при 0,100 н
E. Процедура:
1. Ферментний препарат:
a. Розрахунок ферментного препарату
Вага {{0}}/цільова активність (приблизно 0,05 г або 50 мг)
A. Точно зважте фермент у мірну колбу на 50 мл
B. Додайте 8,3 мл буферного розчину.
b. Дати постояти 30 хвилин при кімнатній температурі.
C. Розведіть дистильованою водою з рН 4,5 до 50 мл, додайте маленьку мішалку та перемішуйте ще 10-15 хвилин.
2. Ферментна процедура:
a. Внесіть піпеткою 25 мл желатинового субстрату в кожну з двох склянок об’ємом 100 мл, що містять мішалки, і помістіть їх на водяну баню при температурі 45 градусів на 5 хвилин, одну для досліджуваного розчину, а іншу – для холостого розчину.
b. Тестове рішення:
1) Додайте 1.0 мл розчину порошку бромелайнового ферменту в склянку, призначену для тестового розчину, почніть вимірювати час і покрутіть.
2) Після рівно 20 хвилин інкубації при 45 градусах додайте 0,1 мл 3% перекису водню та перемішайте.
3) Інкубуйте ще 5 хвилин.
4) Зніміть склянку з водяної бані та, постійно помішуючи, вставте зонд pH.
5) Запишіть рН через 10 секунд (початковий рН)
6) Доведіть pH до 6.0 за допомогою 0.1 N NaOH. (Приблизно 2-4 мл)
*Примітка: регулюючи pH до 6.0 будьте обережні при pH 5,8; рН зростає повільно, і незначні додавання NaOH у цей момент значно підвищать рН.
7) Продовжуючи постійне помішування, додайте 10 мл 37% формальдегіду рН 9,0.
8) Запишіть pH через 10 секунд і 1 хвилину.
9) Титрувати до рН 9.0 0.1 N NaOH.
10) Запишіть об’єм титрування.
Це тестовий титр, T. c.
Порожній розчин: Порожній розчин слід запускати одночасно з тестовим розчином. Це досягається шляхом початку визначення холостого розчину через 12 хвилин після початку тестового розчину. Це дає вам час для завершення аналізу тестового розчину, перш ніж продовжувати використовувати порожній розчин. 1) Додайте 0.1 мл 3% перекису водню в склянку, призначену для холостого розчину, і перемішайте.
2) Після рівно 20 хвилин інкубації при 45 градусах додайте 1,0 мл розчину бромелаїну та перемішайте.
3) Інкубуйте ще 5 хвилин.
АНАЛІТИЧНИЙ МЕТОД УСТАНОВКИ ТРАВЛЕННЯ ЖЕЛАТИНУ (GDU) - продовж.
4) Зніміть склянку з водяної бані та, постійно помішуючи, вставте зонд pH.
5) Запишіть рН через 10 секунд (початковий рН)
6) Доведіть pH до 6.0 за допомогою 0.1 N NaOH. (Приблизно 2-4 мл)*Див. Примітку вище.
7) Продовжуючи постійне помішування, додайте 10 мл 37% формальдегіду рН 9,0.
8) Запишіть pH через 10 секунд і 1 хвилину.
9) Титрувати до рН 9.0 0.1 N NaOH.
10) Запишіть об’єм титрування. Це порожній титр, B.
F. Розрахунок:
1. Визначення: одна одиниця перетравлення желатину — це така кількість ферменту, яка вивільнить після 20 хвилин розщеплення при 45 градусах 1 мг амінного азоту зі стандартного розчину желатину при pH 4,5 або pH 5,5 (GDU pH 4,5 або pH 5,5).
GDU/г {{0}} (TB) x 14 x N x 50 Wt (г) Де: T=Тестовий титр (мл 0.1 N NaOH) B=Холостий титр (мл 0,1 N NaOH) N=Нормальність стандартизованого NaOH (тобто 0,100) Вага (г)=Початкова маса ферменту
G. Параметри тестування:
1. Ферментні препарати розводять до концентрації приблизно 0.001 г/мл (1 мг/мл) або для порошкового концентрату бромелайнового ферменту приблизно 1-2 GDU/мл. Еталонний матеріал аналізується під час кожного циклу, щоб забезпечити точність методу.
Guanjie постачає масовий порошок бромелайну, використовуючи метод випробування GDU. Наш виробничий процес працює відповідно до стандартних майстерень CGMP, використовуючи три виробничі лінії на двох фабриках і дві незалежні лабораторії. З будь-якими запитаннями щодо нашої продукції звертайтеся до нас за адресоюinfo@gybiotech.com.
